Введение в принципы:
Принцип мультиплексной иммуногистохимии (mIHC) заключается в том, что антиген на срезах тканей специфически связывается с первичным антителом. Затем добавляется вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), для связывания с первичным антителом. После добавления субстрата флуоресценции тирамина, нактивированные субстраты тирамина флуоресцеина активируются пероксидом водорода, катализируемым HRP. При добавлении субстрата флуоресцеина неактивированный субстрат тирамин флуоресцеина каталитически активируется HRP в присутствии перекиси водорода. Активированный субстрат ковалентно связывается с близлежащими остатками белка, включая триптофан, гистидин и тирозин, что обеспечивает стабильное связывание антигена с флуоресцеином.
В экспериментах по мультиплексной маркировке нековалентно связанные первичные и вторичные антитела из предыдущего раунда можно смыть с помощью тепловой репарации или элюента антител. Затем инкубируют следующий раунд первичного вторичного антитела HRP, после чего наносят другой субстрат тирозин флуоресцеина. Этот процесс можно повторять для достижения нескольких этапов маркировки. Поскольку в каждой системе одновременно инкубируется только одно антитело, нет необходимости беспокоиться о перекрестной реактивности антител или необходимости сопоставлять первичные и вторичные антитела, что значительно снижает проблемы, связанные с выбором и сопоставлением антител из разных видов в экспериментальном дизайне.
Набор содержит специфические флуоресцентные красители тирамина, которые включают один или несколько из следующих: TYR-480Plus, TYR-520Plus, TYR-570Plus, TYR-620Plus, TYR-690Plus и TYR-780Plus. Эти флуоресцентные красители можно использовать по отдельности или в комбинации, что позволяет проводить одинарную, двойную, тройную или даже более сложную амплификацию флуоресценции и маркировку гомологичных антител, что значительно повышает универсальность набора.
Наш Наборы Multi Fluorescence Staining Plus (mIHC) в настоящее время позволяют получить до 9 цветов. Комбинации красителей подробно описаны в таблице ниже:
Компоненты комплекта:
Флуоресцентные красители TYR-***Plus, буфер TSA, универсальные вторичные антитела козы против мышиных/кроличьих антител HRP, окрашивающий раствор DAPI (готовый к использованию), разбавитель антител, 3% перекись водорода.
Преимущества мультифлуоресцентного окрашивания Plus(мИГХ) Комплекты:
1.Высокая чувствительность, в 10-50 раз выше, чем у обычных наборов для анализа TSA,
2.Будьте осторожны, чтобы не получить слишком сильный сигнал. Если сигнал слишком сильный, концентрация красителя/время реакции/концентрация первичных антител будут снижены.
3.Если сигнал слишком слабый, увеличьте концентрацию красителя/время реакции/концентрацию первичных антител;
4.Чем выше концентрация набора Multi Fluorescence Staining Plus (mIHC), тем экспоненциально усиливается сигнал; при концентрации 1:50 можно получить самый сильный сигнал, а концентрация 1:500 эквивалентна сигналу обычного набора TSA.
5.Набор Multi Fluorescence Staining Plus (mIHC) обладает высокой устойчивостью к тушению флуоресцентных красителей и не требует воздействия солнечного света в течение всего процесса. Он также не требует работы в темной среде во время использования, но не может подвергаться воздействию солнечного света.
Процедура оперативного окрашивания:
Пример визуализации с использованием нашНабор для мультифлуоресцентного окрашивания Plusс:
(A) Индекс ткани фаллопиевой трубы человека A (570 желтый) + индекс B (520 зеленый) + индекс C (690 порошок);
(B) Индекс ткани почки мыши A (570 желтый) + индекс B (520 зеленый) + индекс C (690 порошок);
(C) Индикатор опухоли рака желудка человека A (690 порошок) + индикатор B (620 красный) + индикатор C (570 желтый) + индикатор D (520 зеленый); (D) Индекс ткани кишечника человека A (570 желтый) + индекс B (520 зеленый) + индекс C (690 розовый) + индекс D (620 красный) + индекс E (480 зеленый).
