सिद्धांत परिचय:
मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mIHC) का सिद्धांत यह है कि ऊतक खंडों पर एंटीजन विशेष रूप से प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ता है। फिर, प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ने के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) के साथ संयुग्मित एक द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ा जाता है। टायरामाइन फ्लोरोसेंस सब्सट्रेट जोड़ने के बाद, एनऑन-एक्टिवेटेड टायरामाइन फ्लोरेसिन सब्सट्रेट एचआरपी-उत्प्रेरित हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा सक्रिय होते हैं. फ्लोरेसिन सब्सट्रेट को जोड़ने पर, गैर-सक्रिय टायरामाइन फ्लोरेसिन सब्सट्रेट को हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में एचआरपी द्वारा उत्प्रेरक रूप से सक्रिय किया जाता है। सक्रिय सब्सट्रेट ट्रिप्टोफैन, हिस्टिडीन और टायरोसिन सहित आस-पास के प्रोटीन अवशेषों से सहसंयोजक रूप से बंधता है, जिससे स्थिर एंटीजन-फ्लोरेसिन बंधन की अनुमति मिलती है।
मल्टीप्लेक्स लेबलिंग प्रयोगों में, पिछले दौर से गैर-सहसंयोजक रूप से बंधे प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को हीट रिपेयर या एंटीबॉडी एलुएंट का उपयोग करके धोया जा सकता है। इसके बाद, प्राथमिक-एचआरपी द्वितीयक एंटीबॉडी के अगले दौर को इनक्यूबेट किया जाता है, उसके बाद एक अलग टायरोसिन फ्लोरेसिन सब्सट्रेट का अनुप्रयोग किया जाता है। कई लेबलिंग चरणों को प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराया जा सकता है। चूंकि प्रत्येक सिस्टम में एक समय में केवल एक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट किया जाता है, इसलिए एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी या प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के मिलान की आवश्यकता के बारे में कोई चिंता नहीं है, जिससे प्रायोगिक डिजाइन में विभिन्न प्रजातियों से एंटीबॉडी के चयन और मिलान से जुड़ी चुनौतियों में काफी कमी आती है।
किट में विशिष्ट टायरामाइन फ्लोरोसेंट रंग होते हैं, जिनमें निम्न में से एक या अधिक शामिल हैं: TYR-480Plus, TYR-520Plus, TYR-570Plus, TYR-620Plus, TYR-690Plus, और TYR-780Plus। इन फ्लोरोसेंट रंगों का इस्तेमाल व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में किया जा सकता है, जिससे सिंगल, डबल, ट्रिपल या इससे भी अधिक जटिल फ्लोरोसेंस एम्पलीफिकेशन और समरूप एंटीबॉडी लेबलिंग की अनुमति मिलती है, जिससे किट की बहुमुखी प्रतिभा में काफी वृद्धि होती है।
हमारा मल्टी फ्लोरोसेंस स्टेनिंग प्लस (mIHC) किट वर्तमान में 9 रंगों तक प्राप्त कर सकते हैं। नीचे दी गई तालिका में डाई संयोजनों का विवरण दिया गया है:
किट घटक:
TYR-***प्लस फ्लोरोसेंट डाईज़, टीएसए बफर, एचआरपी बकरी एंटी माउस/खरगोश यूनिवर्सल सेकेंडरी एंटीबॉडी, डीएपीआई स्टेनिंग सॉल्यूशन (रेडी-टू-यूज़), एंटीबॉडी पतला, 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड।
मल्टी फ्लोरोसेंस स्टेनिंग प्लस के लाभ(एमआईएचसी) किट:
1.उच्च संवेदनशीलता, पारंपरिक टीएसए परख किट की तुलना में 10-50 गुना अधिक,
2.ध्यान रखें कि संकेत बहुत अधिक प्रबल न हो; यदि संकेत बहुत अधिक प्रबल है, तो डाई सांद्रता/प्रतिक्रिया समय/प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता कम हो जाएगी,
3.यदि संकेत बहुत कम है, तो डाई सांद्रता/प्रतिक्रिया समय/प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ाएँ;
4.मल्टी फ्लोरोसेंस स्टेनिंग प्लस (एमआईएचसी) किट की सांद्रता जितनी अधिक होगी, सिग्नल में उतनी ही तेजी से वृद्धि होगी; 1: 50 सबसे मजबूत सिग्नल प्राप्त कर सकता है, और 1: 500 एक पारंपरिक टीएसए किट के सिग्नल के बराबर है।
5.मल्टी फ्लोरोसेंस स्टेनिंग प्लस (mIHC) किट में फ्लोरोसेंट रंगों के लिए मजबूत शमन प्रतिरोध है, और पूरी प्रक्रिया के दौरान इसे सूर्य के प्रकाश के संपर्क में आने की आवश्यकता नहीं होती है। इसके उपयोग के दौरान इसे अंधेरे वातावरण में संचालन की भी आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन इसे सूर्य के प्रकाश के संपर्क में नहीं लाया जा सकता है।
परिचालन धुंधला प्रक्रिया:
इमेजिंग का उपयोग करने का उदाहरण हमारामल्टी फ्लोरोसेंस स्टेनिंग प्लस किटएस:
(ए) मानव फैलोपियन ट्यूब ऊतक सूचकांक ए (570 पीला) + सूचकांक बी (520 हरा) + सूचकांक सी (690 पाउडर);
(बी) माउस किडनी ऊतक सूचकांक ए (570 पीला) + सूचकांक बी (520 हरा) + सूचकांक सी (690 पाउडर);
(सी) मानव गैस्ट्रिक कैंसर ट्यूमर सूचक ए (690 पाउडर) + सूचक बी (620 लाल) + सूचक सी (570 पीला) + सूचक डी (520 हरा); (डी) मानव आंत्र ऊतक सूचकांक ए (570 पीला) + सूचकांक बी (520 हरा) + सूचकांक सी (690 गुलाबी) + सूचकांक डी (620 लाल) + सूचकांक ई (480 हरा)।
