مقدمه اصل:
اصل ایمونوهیستوشیمی مولتیپلکس (mIHC) این است که آنتی ژن روی بخش های بافتی به طور خاص به آنتی بادی اولیه متصل می شود. سپس، یک آنتی بادی ثانویه کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی (HRP) برای اتصال به آنتی بادی اولیه اضافه می شود. پس از افزودن زیرلایه فلورسانس تیرامین، nسوبستراهای تیرامین فلورسین فعال شده توسط پراکسید هیدروژن کاتالیز شده با HRP فعال می شوند.. پس از افزودن یک بستر فلورسئین، بستر تیرامین فلورسین غیرفعال شده توسط HRP در حضور پراکسید هیدروژن به صورت کاتالیزوری فعال می شود. سوبسترای فعال شده به صورت کووالانسی به باقی مانده های پروتئینی مجاور مانند تریپتوفان، هیستیدین و تیروزین متصل می شود و امکان اتصال پایدار آنتی ژن-فلورسین را فراهم می کند.
در آزمایش‌های برچسب‌گذاری مولتی پلکس، آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه غیرکووالانسی از دور قبلی را می‌توان با استفاده از ترمیم حرارتی یا یک ماده شوینده آنتی‌بادی شستشو داد. متعاقبا، دور بعدی آنتی بادی ثانویه اولیه-HRP انکوبه می شود و به دنبال آن از یک بستر تیروزین فلورسین متفاوت استفاده می شود. این فرآیند را می توان برای دستیابی به چندین مرحله برچسب گذاری تکرار کرد. از آنجایی که تنها یک آنتی بادی در یک زمان در هر سیستم انکوبه می شود، هیچ نگرانی در مورد واکنش متقاطع آنتی بادی یا نیاز به تطبیق آنتی بادی های اولیه و ثانویه وجود ندارد، و به طور قابل توجهی چالش های مربوط به انتخاب و تطبیق آنتی بادی ها از گونه های مختلف در طراحی آزمایشی را کاهش می دهد.
این کیت حاوی رنگهای فلورسنت تیرامین خاص است که شامل یک یا چند مورد از موارد زیر است: TYR-480Plus، TYR-520Plus، TYR-570Plus، TYR-620Plus، TYR-690Plus، و TYR-780Plus. این رنگهای فلورسنت را می‌توان به‌صورت جداگانه یا ترکیبی مورد استفاده قرار داد، که امکان تقویت فلورسانس منفرد، دوگانه، سه‌گانه یا حتی پیچیده‌تر و برچسب‌گذاری آنتی‌بادی همولوگ را فراهم می‌آورد که تطبیق‌پذیری کیت را تا حد زیادی افزایش می‌دهد.
ما کیت های Multi Fluorescence Staining Plus (mIHC) در حال حاضر می توانند تا 9 رنگ را بدست آورند. ترکیب رنگ ها در جدول زیر به تفصیل آمده است:
اجزای کیت:
رنگهای فلورسنت TYR-*** Plusبافر TSA، آنتی بادی ثانویه جهانی ضد موش/خرگوش بز HRP، محلول رنگ آمیزی DAPI (آماده مصرف)، رقیق کننده آنتی بادی، پراکسید هیدروژن 3 درصد.
مزایای Multi Fluorescence Staining Plus(mIHC) کیت ها:
1.حساسیت بالا، 10-50 برابر بیشتر از کیت های سنجش TSA معمولی،
2.مراقب باشید که سیگنال خیلی قوی نداشته باشید. اگر سیگنال خیلی قوی باشد، غلظت رنگ / زمان واکنش / غلظت آنتی بادی اولیه کاهش می یابد.
3.اگر سیگنال خیلی کم است، غلظت رنگ/زمان واکنش/غلظت آنتی بادی اولیه را افزایش دهید.
4.هرچه غلظت کیت‌های رنگ‌آمیزی چند فلورسانس پلاس (mIHC) بیشتر باشد، سیگنال به‌طور تصاعدی افزایش می‌یابد. 1:50 می تواند قوی ترین سیگنال را بدست آورد و 1:500 معادل سیگنال یک کیت TSA معمولی است.
5.کیت Multi Fluorescence Staining Plus (mIHC) دارای مقاومت خاموش کننده قوی در برابر رنگ های فلورسنت است و نیازی به قرار گرفتن در معرض نور خورشید در طول کل فرآیند ندارد. همچنین در حین استفاده نیازی به کار در محیط تاریک ندارد، اما نمی تواند در معرض نور خورشید قرار گیرد.
روش رنگ آمیزی عملیاتی:
نمونه ای از تصویربرداری با استفاده از ماکیت پلاس رنگ آمیزی چند فلورسانسس:
(الف) شاخص بافت لوله فالوپ انسانی A (570 زرد) + شاخص B (520 سبز) + شاخص C (690 پودر).
(B) شاخص بافت کلیه موش A (570 زرد) + شاخص B (520 سبز) + شاخص C (690 پودر).
(C) نشانگر تومور سرطان معده انسان A (690 پودر) + شاخص B (620 قرمز) + شاخص C (570 زرد) + شاخص D (520 سبز). (د) شاخص بافت روده انسان A (570 زرد) + شاخص B (520 سبز) + شاخص C (690 صورتی) + شاخص D (620 قرمز) + شاخص E (480 سبز).
